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細菌的簡單染色和革蘭氏染色

放大字體  縮小字體 發布日期:2010-09-01  瀏覽次數:11832
核心提示:(一)實驗目的:學習細菌的簡單染色法和革蘭氏染色法。(二)實驗原理:用于生物染色的染料主要有堿性染料、酸性染料和中性染

(一)實驗目的:學習細菌的簡單染色法和革蘭氏染色法。

(二)實驗原理:用于生物染色的染料主要有堿性染料、酸性染料和中性染料三大類。堿性染料的離子帶正電荷,能和帶負電荷的物質結合。因細菌蛋白質等電點較低,當它生長于中性、堿性或弱酸性的溶液中時常帶負電荷,所以通常采用堿性染料(如美藍、結晶紫、堿性復紅或孔雀綠等)使其著色。酸性染料的離子帶負電荷,能與帶正電荷的物質結合。當細菌分解糖類產酸使培養基pH下降時,細菌所帶正電荷增加,因此易被伊紅、酸性復紅或剛果紅等酸性染料著色。中性染料是前兩者的結合物又稱復合染料,如伊紅美藍、伊紅天青等。

簡單染色法是只用一種染料使細菌著色以顯示其形態,簡單染色不能辨別細菌細胞的構造。

革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學家C.Gram所創立的。革蘭氏染色法可將所有的細菌區分為革蘭氏陽性菌(G+)和革蘭氏陰性菌(G)兩大類,是細菌學上最常用的鑒別染色法。

該染色法所以能將細菌分為G+菌和G,是由這兩類菌的細胞壁結構和成分的不同所決定的。G菌的細胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質,而且聚糖層較薄、交聯度低,故用乙醇或丙酮脫色時溶解了類脂質,增加了細胞壁的通透性,使初染的結晶紫和碘的復合物易于滲出,結果細菌就被脫色,再經蕃紅復染后就成紅色。G+菌細胞壁中肽聚糖層厚且交聯度高,類脂質含量少,經脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小,通透性降低,因此細菌仍保留初染時的顏色。

(三)實驗器材

1、活材料:培養12-16h的蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis)或者枯草桿菌(Bacillus subtilis),培養24小時的大腸桿菌Escherichia coli

2、染色液和試劑:結晶紫附二、、3、盧哥氏碘液(附二、4、95%酒精、附二、、5、復紅附二、2、二甲苯、香柏油

3、器材:廢液缸、洗瓶、載片、接種杯、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡

(四)實驗方法:

1、簡單染色:

1)涂片:取干凈載片一塊,在載片的左、右各加一滴蒸餾水,按無菌操作法取菌涂片,左邊涂蘇云金桿菌,右邊涂大腸桿菌,做成濃菌液。再取干凈載片一塊將剛制成的蘇云金桿菌濃菌液挑2-3環涂在左邊制成薄的涂面,將大腸桿菌的濃菌液取2-3環涂在右邊制成薄涂面。亦可直接在載上制薄的涂面,注意取菌不要太多。

2)晾干:讓涂片自然晾干或者在酒精燈火焰上方文火烘干。

3)固定:手執片一端,讓菌膜朝上,通過火焰2-3次固定(以不燙手為宜)

4)染色:將固定過的涂片放在廢液缸上的擱架上,加復紅染色1-2min。

5)水洗:用水洗去涂片上的染色液

6)干燥:將洗過的涂片放在空氣中晾干或用吸水紙吸干。

7)鏡檢:先低觀察,再高倍觀察,并找出適當的視野后,將高倍鏡轉出,在涂片上加香柏油一滴,將油鏡頭浸入油滴中仔細調焦觀察細菌的形態。

2、革蘭氏染色:

1)涂片:涂片方法與簡單染色涂片相同。

2)晾干:與簡單染色法相同。

3)固定,與簡單染色法相同

4)結晶紫色染色:將片置于廢液缸片擱架上,加適量(以蓋滿細菌涂面)的結晶紫染色液染色1分鐘。

5)水洗:傾去染色液,用水小心地沖洗。

6)媒染滴加盧哥氏碘液,媒染1min。

7)水洗:用水洗去碘液

8)脫色:將片傾斜,連續滴加95%乙醇脫色20—25s至流出液無色,立即水洗。

9)復染:滴加蕃紅復染5min。

10)水洗:用水洗去涂片上的紅染色液。

11)晾干:將染好的涂片放空氣中晾干或者用吸水紙吸干。

12)鏡檢:鏡檢時先用低,再用高倍,最后用油鏡觀察,并判斷菌體的革蘭氏染色反應性。

13)實驗完畢后的處理:

將浸過油的鏡頭按下述方法擦拭干凈,a.先用擦鏡紙將油鏡頭上的油擦去。b.用擦鏡紙沾少許二甲苯將鏡頭擦2—3次。c.再用干凈的擦鏡紙將鏡頭擦2—3次。注意擦鏡頭時向一個方向擦拭。

②看后的染色片用廢紙將香柏油擦干凈。

(五)實驗作業

給出Bacillus thuringiensisEscherichia coli的形態圖,并注明兩菌的革蘭氏染色的反應性。

(六)注意事項

1.革蘭氏染色成敗的關鍵是酒精脫色。如脫色過度,革蘭氏陽性菌也可被脫色而染成陰性菌;如脫色時間過短,革蘭氏陰性也會被染成革蘭氏陽性菌。脫色時間的長短還受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影響,難以嚴格規定。

2.染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后,應吸去玻片上的殘水,以免染色液被稀釋而影響染色效果。

3.選用幼齡的細菌。G+菌培養12h-16h,E.coli培養24h。若菌齡太老,由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉呈陰性反應。

編輯:foodadmin

 
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