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菌種保存過程的常見問題?看看專家怎么解答!

放大字體  縮小字體 發布日期:2022-05-09  瀏覽次數:1905
核心提示:分離純化后才能獲得單一菌株,單一菌株進行菌種保藏才有意義,防止菌種交叉污染和變異,這也是菌種保存的基本原則1、菌種保存管能
 

分離純化后才能獲得單一菌株,單一菌株進行菌種保藏才有意義,防止菌種交叉污染和變異,這也是菌種保存的基本原則

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1、菌種保存管能保存霉菌及酵母菌嗎?

 

答:可以。對于霉菌等真菌需培養7 天進行保存,而酵母菌需培養三天將孢子洗脫下來進行保存,保存管中的小瓷珠可以作為介質來吸附孢子和菌絲,相當于砂土保存法中砂土作為載體起到的作用。

 

2、所有的菌都能保存嗎?如果不是的話,什么樣的菌可以保存?什么樣的菌不可以保存?

 

答:可以。菌種保存的原理是預防或減緩DNA 復制時自發突變導致菌種退化,因此要創造代謝不活潑的狀態,而菌種保存時使菌種進入休眠態(孢子、芽孢),并創造干燥、低溫、缺氧、缺營養的環境,創造的環境越接近此狀態,所保存的菌種的時間就越長,所以從原理上講,所有菌種都可用這種方法保存, 但需要注意的是,苛刻菌(如流感嗜血桿菌、腦膜炎萘瑟氏菌)等特殊細菌保存時,需-80℃或更低溫度保存,才可以做到更長期的保存。

 

3、能用菌種保存管永久保存菌株嗎?

 

答:溫度越低,保藏效果越好。從目前的試驗數據及實際保存效果來看,-20℃可保存1-5 年,-80℃或液氮中可保存5-10 年,不同菌種及不同的保存溫度保存時間會有所不同(例如:大腸、沙門等常規細菌-20℃我們目前可以保存到6年)。但需要注意的是所保存的菌種需每年抽檢進行生化特征的鑒定,確定菌株無變異。


4.菌株保存的是第三代,-80℃保存,再取出來活化的話屬于第幾代?

:保存的是第三代復活出來后,如果采用平板或肉湯活化相當于轉接了一代,就是第四代了,如果還在瓷珠里的話就還是原來的代數。如果是保存在斜面上,這一支斜面一直就是第三代,如果轉接到另一支斜面就是第四代了。傳代原則,菌株活化復蘇不論以任何形式繁殖了一次就算是傳了一代。但如果僅是物理位置的轉移沒有繁殖就不是傳代,需要注意。

 

5.剛買回來的陽性菌株是第0代嗎?

:一般菌株你買回來的時候上面都會寫明第幾代,常規來說都是第0代的。像購買的ATCC或CICC的凍干粉都是標記為0代的。

6.菌株傳代保存到瓷珠里一定要挑單菌落嗎?

:不一定非挑單菌落,但是一定要挑相同特征的菌落,就是說從同一個菌落純化出來的,以保證它們的特性完全一致。原則是盡量多挑,寧多勿少。 


7.怎樣延長菌株的保存時間呢?

大量的實驗證明菌株在低溫、干燥、缺氧、缺營養的條件下保存效果是最好的,越接近這種保存條件,菌株的保存時間越長。

 

8.怎樣純化菌株?

純化就是從TSA上或別的非選擇性平板上轉接一次,這就相當于純化了。

 

9. 我們保存的一代菌株是不是要重新傳代保存呢,認證老師會不會認為這是個錯誤?

答:應該不會,認證老師不會提出這種問題的,不過最好是一代菌株保存一些、二代菌株保存一些,使用時工作菌株最好使用第三代菌株,一代菌株可作為長期保存用。

10. 為何要將第三代作為工作菌株?

答:多傳代幾次后菌株的活力會明顯提高,但最多傳代到第五代后就不能用了,因為第五代后菌株雖然不會完全變異,但變異率會明顯增加,因此選用第三代作為工作菌株是比較合適的,若使用第一、第二代菌株活力沒有那么強。

 

11.用瓷珠管反復上下搖勻,有泡沫不容易吸出來,怎么辦?

答:不必特別劇烈大尺度的搖動瓷珠管,稍微上下晃動就可以;如果確實有泡沫的話可以靜置一會,讓菌株多吸附一下瓷珠也是可以的。

 

12. TSA斜面一般多少度保存,可以放在冷藏里嗎?

答:2-8℃保存,放在冷藏是可以的;注意弧菌和綠膿桿菌要放到室溫20-25℃保存,否則會很快死亡。

 

13.如果TSA斜面放在冷凍里面,會有什么影響?

答:瓊脂冷凍后性狀會發生改變,會變得很軟,結構發生改變,所以不建議冷凍;如果要冷凍的話就采用甘油保存法或瓷珠保存法。

 

14.用瓷珠管保存產氣莢膜梭菌老是保存不好!做好瓷珠管之后瓷珠管要放到厭氧袋里面再放到-20℃么?

答:如果冷凍保存最好放在厭氧袋里再-20°保存,保存效果還可以;或者可以采用庖肉培養基保存,它是一種液體培養基,將產氣莢膜梭菌接進去然后2-8 ℃保存,可以保存一年沒有問題,在厭氧環境下保存效果最好。

 

15、菌種保藏時為什么要進行分離純化?

 

答:分離純化后才能獲得單一菌株,單一菌株進行菌種保藏才有意義,防止菌種交叉污染和變異,這也是菌種保存的基本原則。

 

16、菌種保存管對于平板來說,對挑選菌落個數有要求嗎?還是將整個平板的菌落全部刮入管中?

 

答:對于要保存的細菌一般是要進行2-3 次的純化,要保證一個平板上的菌是由單一菌落傳代而來的,所以在細菌保存的過程中,為了保證制備的菌懸液可以達到3-4MCF,是可以將整個平板的的細菌全部刮到管中的,如果平板長的比較滿一般半個平板就夠用,具體用量也根據菌種的不同有所差異,如霉菌、酵母菌在保存時,不適合用濁度法。

 

17、對于液體培養基培養的純菌,是否也可以用咱們的菌種保存管?如果可以的話,怎么操作?

 

答:是可以用的,如果液體培養基能保證是純菌的話,可以直接離心,棄掉上清,然后把保存管中液體吸進去充分混勻,然后再轉移到菌種保存管中,整個過程要注意無菌操作。不過,一般菌種保存管最好選擇平板菌落進行保存,因為液體培養基中有雜菌是不易觀察出來的。

 

18、為什么在菌種保存時,要上下顛倒?為什么不能旋搖?

 

答:上下顛倒,可使菌懸液充分混勻,菌株充分、均勻地吸附到小瓷珠上,旋搖不利于菌懸液充分混勻,反而會使菌株全部沉淀于管底。

 

19、為什么在使用時要將管內的液體盡可能多的吸出?

 

答:吸出液體可避免反復凍融形成的冰晶對菌株的損傷,加快復蘇的過程,因此,要盡可能的將與菌種混勻后的保存液吸凈。而常用的甘油法,在復蘇的過程中需用水浴鍋快速溶解,在此過程中,對菌株傷害較大。

 

20、在使用后,菌種保存管的保存環境?需要-80℃冰箱嗎?

 

答:本公司菌種保存管采用的是低溫冷凍保存法,因此,使用后,需放置低溫環境,如-20℃、-80℃或液氮中保存,而且溫度越低,保存效果越好。用戶需根據菌種的保存要求選擇具體保存溫度。

 

21、為什么說,如果有條件的話,菌種保存管最好置于-80 冰箱或液氮中?

 

答:因為,貯存在-70℃以下低溫中能減少冰晶形成,可極大降低冰晶形成對細菌的傷害,同時可為被保存的菌種創造更低的代謝環境,從而延長細菌保存的時間。

 

22.菌株保存是-70℃還是-80℃有具體標準規定么?

:其實是有標準的,《SN/T 2632-2010 微生物菌株常規保藏技術規程》是關于菌株保藏的一個標準,大家可以學習一下,各個保存方式都有介紹,但是瓷珠是比較新興的保存方式暫時里面還沒有收錄。

 

23、為什么在取用菌株時,操作過程要求快速?

 

答:菌種保存復蘇的原則,要求慢凍快融,之所以要求快速,是因為在菌種復蘇的過程中, 長時間的溶解過程會對所保存的菌種造成損傷,而我們經過改良的保存方法最大程度的避免復蘇所造成的影響,但我們還是建議遵循菌種的保存復蘇原則,保證所復蘇菌種的復蘇率。

 

24、將菌株反復凍存,到底對菌株有什么影響?

 

答:低溫會使菌株細胞內的水分形成冰晶,從而引起細胞結構尤其是細胞膜的損傷。細胞體積大者一般要比較小者對低溫更為敏感,而無細胞壁者則比有細胞壁者敏感。如果放到低溫(不是一般冰箱)進行冷凍時,會產生冰晶,冰晶呈針狀,極易導致細菌的嚴重損傷。用電鏡觀察,可見細菌的核膜上有大量針尖樣小孔,當從低溫下移出并開始升溫時,冰晶又會變大,故反復凍存,會對菌株造成極大損傷。


編輯:songjiajie2010

 
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