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還原糖和總糖的測定3,5-二硝基水楊酸比色法

放大字體  縮小字體 發布日期:2011-05-20  來源:丁香通  瀏覽次數:23439
核心提示:還原糖和總糖的測定3,5-二硝基水楊酸比色法

一、目的
掌握還原糖和總糖測定的基本原理,學習比色法測定還原糖的操作方法和分光光度計的使用。
二、原理
還原糖的測定是糖定量測定的基本方法。還原糖是指含有自由醛基或酮基的糖類,單糖都是還原糖,雙糖和多糖不一定是還原糖,其中乳糖和麥芽糖是還原糖,蔗糖和淀粉是非還原糖。利用糖的溶解度不同,可將植物樣品中的單糖、雙糖和多糖分別提取出來,對沒有還原性的雙糖和多糖,可用酸水解法使其降解成有還原性的單糖進行測定,再分別求出樣品中還原糖和總糖的含量(還原糖以葡萄糖含量計)。
還原糖在堿性條件下加熱被氧化成糖酸及其它產物,3,5-二硝基水楊酸則被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內,還原糖的量與棕紅色物質顏色的深淺成正比關系,利用分光光度計,在540nm波長下測定光密度值,查對標準曲線并計算,便可求出樣品中還原糖和總糖的含量。由于多糖水解為單糖時,每斷裂一個糖苷鍵需加入一分子水,所以在計算多糖含量時應乘以0.9。


 
三、實驗材料、主要儀器和試劑
1. 實驗材料
小麥面粉;精密pH 試紙。
2. 主要儀器
(1)具塞玻璃刻度試管:20mL×11
(2)大離心管:50mL×2
(3)燒杯:100mL×1
(4)三角瓶:100mL×1
(5)容量瓶:100mL×3
(6)刻度吸管:1mL×1;2mL×2;10mL×1
(7)恒溫水浴鍋
(8)沸水浴
(9)離心機
(10)扭力天平
(11)分光光度計
3. 試劑
(1)1mg/mL 葡萄糖標準液
準確稱取80℃烘至恒重的分析純葡萄糖100mg,置于小燒杯中,加少量蒸餾水溶解后,轉移到100mL 容量瓶中,用蒸餾水定容至100mL,混勻,4℃冰箱中保存備用。
(2)3,5-二硝基水楊酸(DNS)試劑
將6.3gDNS 和262mL 2M NaOH 溶液,加到500mL含有185g 酒石酸鉀鈉的熱水溶液中,再加5g結晶酚和5g亞硫酸鈉,攪拌溶解,冷卻后加蒸餾水定容至1000mL,貯于棕色瓶中備用。
(3)碘-碘化鉀溶液:稱取5g碘和10g碘化鉀,溶于100mL蒸餾水中。
(4)酚酞指示劑:稱取0.1g酚酞,溶于250mL70%乙醇中。
(5)6M HCl 和6M NaOH各100mL。
四、操作步驟
1. 制作葡萄糖標準曲線
取7支20mL 具塞刻度試管編號,按表1分別加入濃度為1mg/mL 的葡萄糖標準液、蒸餾水和3,5-二硝基水楊酸(DNS)試劑,配成不同葡萄糖含量的反應液。

                             表1 葡萄糖標準曲線制作
2. 樣品中還原糖和總糖的測定
(1)還原糖的提取
準確稱取3.00g 食用面粉,放入100mL 燒杯中,先用少量蒸餾水調成糊狀,然后加入50mL 蒸餾水,攪勻,置于50℃恒溫水浴中保溫20min,使還原糖浸出。將浸出液(含沉淀)轉移到50mL 離心管中,于4000r/min下離心5min,沉淀可用20mL 蒸餾水洗一次,再離心,將二次離心的上清液收集在100mL容量瓶中,用蒸餾水定容至刻度,混勻,作為還原糖待測液。
(2)總糖的水解和提取
準確稱取1.00g食用面粉,放入100mL三角瓶中,加15mL蒸餾水及10mL 6M HCl,置沸水浴中加熱水解30min(水解是否完全可用碘-碘化鉀溶液檢查)。待三角瓶中的水解液冷卻后,加入1 滴酚酞指示劑,用6mol/LNaOH 中和至微紅色,用蒸餾水定容在100mL容量瓶中,混勻。將定容后的水解液過濾,取濾液10mL,移入另一100mL容量瓶中定容,混勻,作為總糖待測液。
(3)顯色和比色
取4支20mL 具塞刻度試管,編號,按表2 所示分別加入待測液和顯色劑,空白調零可使用制作標準曲線的0號管。加熱、定容和比色等其余操作與制作標準曲線相同。

五、結果與計算:
計算出7、8號管光密度值的平均值和9、10管光密度值的平均值,在標準曲線上分別查出相應的還原糖毫克數,按下式計算出樣品中還原糖和總糖的百分含量。
 
編輯:songjiajie2010

 
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